پایان نامه تعیین ژنوتایپ ویروس هپاتیپ B در اهداء كنندگان 3 استان كرمان، یزد و اصفهان

پایان نامه تعیین ژنوتایپ ویروس هپاتیپ B در اهداء كنندگان 3 استان كرمان، یزد و اصفهان

قسمتی از متن:

PCR Nested :

در روش PCR Nested از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود به طوری كه جفت دوم در بین جفت اول جای می‌گیرد در این روش، ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف، در طول 15-30 چرخه تكثیر می‌شود كه احتمال دارد به میزان دلخواه اختصاصی نباشد. سپس محصول PCR حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحلة دوم PCR انجام شده و ترادف كوچكتری از DNA كه درون محصولPCR رولی است به اندازة 15-40 چرخة تكثیر می‌شود كه خصوصیت آن، تكثیر قسمت داخلی تر یا به عبارت دیگر اختصاصی تر می‌باشد. مزایای این روش تغییر یافتة PCR عبارت است از :

1)     نیاز به پروپ (كاوشگر) و تأییدهای بعدی كمتر است.

2)    حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است.

3)    به دلیل انتقال محصول PCR دور اول به لولة جدید، ممانعت كننده‌ها رقیق می‌شود (یعنی 1386)

ژل الكتروفروز :

یكی از روش‌های متداول مشاهدة محصولات واكنش PCR (به طور كلی DNAی دو رشته‌ای رنگ آمیزی DNA با اتیدیون برومایه و بارگذاری (LOAD) درون چاهك بر روی ژل آكارز است. آگار مخلوطی از دو پلی ساكارید آگارز و آگاروپكتین است كه از چند جلبك دریایی بدست می‌آید. خاصیت ژله‌ای آگار به طور عمده بدلیل وجود آگارز است و خصوصیات نامطلوب آن در حین (الكترواسموز و كد رشدگی) از آگاروپكتین ناشی می‌شود. انواع مختلفی از آگارز را شركت‌های سازنده تولید می‌كنند كه تفاوت آن‌ها در میزان خلوص آگارز از نظر عدم حضور پلی ساكاریدهای باردار(كه موجب الكترواسموز می‌شوند) درجة ذوب، قوام و میزان شفافیت است با برقراری یك جریان  الكتریكی و در حضور بافر عبور دهندة جریان، قطعات DNA كه دارای بار منفی هستند، بر مبنای طول خود با سرعت‌های متفاوتی در ژل آگارز حركت می‌كنند از قطب منفی به سمت قطب مثبت می‌روند و بنابراین به تفكیك طول از یكدیگر جدا می‌شوند در این حالت اگر یك رنگ آشكار ساز مانند اتیدیوم بروماید در بافر الكتروفروز یا ژل موجود باشد در لابه‌لای بازهای DNA ی دو رشته‌ای وارد می‌شود و با استفاده از پرتوهای (ultro violet) همچنین با استفاده از یك اندازه نمای SONA (DNA sizar marker) با پله‌هایی به طول متخصص (به عنوان راهنما برای بررسی نمونه‌های آشكار شده روی ژل) می‌توان DNA را بر روی ژل مشاهده كرد.

توجه به این نكته ضروری است كه قدرت تفكیك ژل در یك محدودة مشخص نسبت مستقیم با غلظت ژل دارد. بنابراین برای آشكار سازی قطعات كوچك یا در مواردی كه هم زمان دو یا چند قطعه با تفاوت طول كم در یك نمونه وجود دارد كه احتیاج به تفكیك بیشتر است، از ژل غلیظتر و برای قطعات بزرگتر یا در مواردی كه  هم زمان دو یا چند قطعه با تفاوت طول بیشتر در یك نمونه وجود دارد كه احتیاج به تفكیك خیلی بالا نیست، از ژلی با غلظت كمتر استفاده می‌شود.

تعیین توالی مولكول DNA  (Soguncing)

امروزه تعیین توالی DNA در زمره اندیشمندترین ابزارهایی است كه در زیست شناسی ملكولی برای شناسایی و تعیین محل دقیق نوكلئوتیدها در ساختمان ژن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

نخستین بار فردریك سنگر (1974) روش تعیین توالی A را با استفاده از دی اكسی نوكلئوتیدتری فسفات‌ها و بر مبنای ساخت DNA معرفی نمود قرار گرفتن این نوكلئوتیدها كه در محل 3 كلكول قند فاقد اكسیژن هستند در عین پلیمراسیون در طول زنجیره DNA موجب ختم سنتز رشته جدید می‌گردد و در صورتی كه بین نوكلئوتیدهای رادیواكتیو نشاندار شده باشند می‌توان محل نوكلئوتیدها را در هر رشته متخصص نمود. 

تقریباً به صورت همزمان روش دیگری برای تعیین توالی بوسیله الن ماگنتام والترگیلبرت ابداه شد كه به روش شكسته شدن شیمیایی معروف است در این روش DNA در محل هر یك از نوكلئوتیدهای چهار گانه بوسیله مواد شیمیایی خاصی شكسته می‌شوند كه پس از الكتروفروز محل نوكلئوتیدها در زنجیره DNA قابل خواندن خواهد بود.

با آغاز پروژه ژنوم انسان روشهای جدید و سریعتری برای تعیین توالی ماده ژنتیكی سلولها مورد نیاز بود. در نظر داشت ه باشید كه محققان مجبور بودند 3 میلیون جفت باز سازنده ساختار ژنتیكی انسان را تعیین توالی كنند. با استفاده از روشهای متداول در حدود 10 سال زمان صرف میلیونها دلار برای این پروژه پیش بینی می‌شد در نتیجه محققین درصدد ابداع روش سریعتر برای تعیین توالی برآمدند. تعیین توالی اتوماتیك DNA بعنوان روش جایگزینی با سرعت و دقت بالا توسط دانشمندان بخش زیست شناسی ساختاری LBL ابداع شد كه 100-50 برابر سریعتر از روشهای پیشین بود در تعیین توالی اتوماتیك نوكلئوتیدها بجای رادیواكتیو با رنگ‌های فلورسانت نشانه دار شده در حین اكترفروز قطعات بر روی ژل اكریل آمید به محلی می‌رسند كه با اشعه لیزر برخورد كرده و پس از تهییج نور فلورسانت خاصی ایجاد می‌شود كه بوسیله دستگاه آشكار ساز دریافت شده و به پیام الكتریكی تبدیل می‌شود این پیامها به كامپیوتر منتقل شده و تا پایان واكنش داده‌ها بصورت اتوماتیك و بوسیله نرم افزارهای ویژه پردازش شده پیكها شناسایی گردید و توالیها كه بصورت فایل متنی درآمده‌اند در اختیار استفاده كنندگان قرار می‌گیرد بدست آوردن نتایج مطلوب و قابل اطمینان از تعیین توالی اتوماتیك تا حد زیادی منوط به تهیه DNA عاری از هر گونه آلودگی با غلظت مناسب می‌باشد. هر گونه آلودگی اعم از نمك، پروتئین، كربوهیدرات، پرایمرها، یا مقدار زیاد DNTP به داده‌های حاصل از تعیین توالی تاثیر می‌گذارد استفاده از كمیت‌های تجاری تهیه و تخلیص DNA كه معمولاً سریع، خوب و قابل اطمینان است معمولاً برای تهیه نمونه DNA در سیستم تعیین توالی اتوماتیك پیشنهاد می‌شود.

كمیت‌های تخلیص DNA به دو روش اساسی بیوشیمیایی هستند. فیلتر سیلیكا كه جدا سازی را بر حسب اندازه نمونه انجام داده و مرحله جداسازی DNA در آب صورت می‌گیرد و دیگر ستون‌های تعویض آنیونی كه مرحله جداسازی DNA در حضور غلظت بالایی از نمك صورت می‌گیرد. تجربه نشان داده است كه نمونه DNA تخلبص شده بافنل – كلروفرم در سیستم تعیین توالی اتوماتیك نتایج مطلوبی نمی‌دهند. استفاده از بافرهای استات پتانسیم برای تهیه نمونه DNA در سیستم تعیین توالی اتوماتیك ترجیح دارد. در صورت استفاده از ستون‌هایی كه بافر جداسازی انها حاوی غلظت بالایی از نمك است می‌توانید یك مرحله اضافی رسوب دهی با الحات آمونیوم (57/757/0) اتانول مطلق 70% در دمای اتاق انجام دهید تا نمك‌های اضافی از نمونه شما حذف گردد مقدار اضافی كمك واكنش تعیین توالی را متوقف می‌نماید DNA جدا شده با بافر غلیظ نمكی از ستون و یا پس از رسوبدهی حداكثر نمك را طی شست و شو با اتانل 70% (حداقل 1 بار و حداكثر 4 بار) باید حذف نمود.

2-3-2 آزمون مولكولی

1-2-3-2 استخراج DNA

از كمیت استخراج اسید نوكلئیك با خلوص بالا (High pure nuckic acidkit) با بر حسب تجاری Roche و شماره كاتالوگ  11858874001 برای استخراج DNAی HBV استفاده شد. این كمیت برای خالص سازی اسید نوكلئیك ویروس ناز سرم، پلاسما یا خون كامل پستانداران طراحی شده است.

مزایای استفاده از این كمیت :   

1-   عدم استفاده از مواد سمی فنل یا كلروفرم

2-   عدم نیاز به استفاده از اتانلی برای رسوب دادن اسید نوكلئیك

3-   آسان بودن روش انجام استخراج در مقایسه با سایر روشهای استخراج

4-   كاهش زمان انجام آزمایش در مقایسه با سایر روشهای استخراج

5-   امكان استخراج RNA , DNA های ویروس موجود در نمونة مرد بررسی به طور همزمان